高速離心機(jī)分離血清脂蛋白的原理與步驟

用電泳法分離含載脂蛋白較高的組份（HDL，VHDL）比較成功，而離心分離法則適合用于各種密度的血清脂蛋白分離。
　　
　　血清脂蛋白是由血液中脂質(zhì)與某些特異的蛋白質(zhì)組成的一類不均一的復(fù)合物。因其所含脂與載脂蛋白的比例不同，其密度范圍在0.96g/ml或更低至1.21g/ml之間。紙電泳中顯示四條帶即：乳密顆粒，極低密度脂蛋白，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白。每種脂蛋白還可以分為更多的亞組分。
　　
　　一．梯度材料：血清脂蛋白密度較低，常用的梯度材料為Nacl,NaI,Kbr,KI等，常用的緩沖劑為ED。
　　
　　二．預(yù)分離：
　　
　　1.血細(xì)胞與血清分離：
　　
　　離心參數(shù)：全血，角轉(zhuǎn)頭，3，000rpm×20min
　　
　　結(jié)果：沉淀為血細(xì)胞，上部為血清。
　　
　　2.乳糜粒分離：禁食12小時(shí)以上人血漿中乳糜粒含量極少，已進(jìn)食者因其血漿含乳糜粒高，應(yīng)先離心去除乳糜粒。
　　
　　離心參數(shù)：4×10（g×min）,10°C.各種轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速均可。
　　
　　梯度液配置：離心管下部3/4容積加血漿，上部1/4容積加0。5MnaCl 0.3MEDTA,ph7.4
　　
　　結(jié)果：乳糜粒上浮，吸出。
　　
　　3.血清蛋白分離：除去球蛋白，白蛋白及其它蛋白質(zhì)。
　　
　　離心參數(shù)：（2。5-3）×10（g×hr）,各種轉(zhuǎn)頭均可。如角轉(zhuǎn)頭70，000rpm×6hrs,10°C
　　
　　配置：管容量1/3為血清，2/3為1。31g/ml,NaCl NaBr,攪拌后終密度為1。21g/ml
　　
　　結(jié)果：管上部1/6容積為血清脂蛋白，下部5/6為其它蛋白。
　　
　　三．方法：
　　
　　1．順序浮選法：
　　
　　a）超速法：zui早使用的方法，4000rpm×24hrs×3次，10°CNaCl NaBr梯度按1。006，1。063，1。21順序浮選，每次在管上部取出不同密度之
　　
　　脂蛋白。操作簡(jiǎn)單，分辨率高，得率高，費(fèi)時(shí)，成本高。
　　
　　b）超高速法：100，000rpm×2.5hrs×2次，10°C,100，000rpm×4hrs×1次，NaCl KBr EDTA梯度按不含密度浮選出VLDL，LDL，HDL
　　
　　2．單次離心法：
　　
　　a）單次水平分離
　　
　　用zui高轉(zhuǎn)速為25，000~28，000rpm,6×40ml甩平轉(zhuǎn)頭以1.006g/mlNaCl液及1。35g/ml（NaCl KBr EDTA）液配置成從1。006至1。21的8層不
　　
　　連續(xù)階梯度，zui下部用血清與KBr配成1。25g/ml樣品液，25，000rpm×4hrs,4oC一次得到VLDL，LDL，HDL不同層區(qū)帶。
　　
　　用zui高轉(zhuǎn)速為40，000rpm，6×13ml甩平轉(zhuǎn)頭，40，000rpm×24hrs，20°C，不連續(xù)KBr梯度1.006~1.21g/ml,細(xì)長(zhǎng)管，分層清晰，回收率
　　
　　高，離心時(shí)間長(zhǎng)
　　
　　b）單次垂直管分離：
　　
　　NaCl/KBr或NaCl/NaBr不連續(xù)梯度單管容量從5ml到40ml，轉(zhuǎn)速從50，000rpm~80，000rpm，離心（0。5-3）hrs,下層用KBr或（NaBr）將血清調(diào)至1
　　
　　。3g/ml上層用1.006g/ml,NaCl液，10°C-20°C，增加，減速一次分出。NaCl/Sucrose不連續(xù)梯度下層為48%W/WSucrose,中層血清在4MnaCl
　　
　　中，上層為0。67MNaCl 0.05%EDTA,離心參數(shù)同上，時(shí)間較長(zhǎng)。
　　
　　c）區(qū)帶轉(zhuǎn)頭大容量分離：
　　
　　離心參數(shù)：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭，zui高轉(zhuǎn)速30，000~48，000rpm,容量從650ml~1900ml,每次可分離血清50-150ml,低速加樣及卸載，分離轉(zhuǎn)速：大轉(zhuǎn)頭
　　
　?。?5,000-28,000rpm）×24hrs，小轉(zhuǎn)頭（30,000-38,000rpm）×1hrs，10°C-20°C
　　
　　梯度液：NaCl NaBr或KBr EDTA不連續(xù)或線性梯度，樣品在zui大密度層，近轉(zhuǎn)頭核心處用純水做隔離層，分離室zui外部用高密度NaCl/KBr或
　　
　　NaCl/NaBr作緩沖層。
　　
　　收集：泵出后依此經(jīng)帶流動(dòng)地的紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，自動(dòng)部分收集器收集。
 

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